IDINEA FERNANDES DOS SANTOS
Título da Dissertação: DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E CITOTOXICIDADE DOS EXTRATOS DE SEMENTE DE MORINGA OLEIFERA LAM. UTILIZADOS EM TRATAMENTO DE ÁGUAS
Orientadora: Profa. Dra. Angélica Marquetotti Salcedo Vieira
Data da Defesa: 26/03/2015
RESUMO GERAL
INTRODUÇÃO - É sabido que a água é de importância vital ao ser humano, e a garantia de sua potabilidade e de suas condições higiênico-sanitárias é de extrema importância para toda a humanidade. A incidência de infecções fatais causadas por consumo de água não tratada tem aumentado em todo o mundo e está e se tornar uma importante causa de mortalidade em países em fase de desenvolvimento. O uso de coagulantes naturais, produzidos no local e com baixo custo, pode diminuir os problemas relacionados ao consumo de água não potável em comunidades afastadas dos grandes centros e de baixa renda. Os coagulantes naturais apresentam várias vantagens em relação aos coagulantes químicos, pois, são biodegradáveis e ainda produzem uma menor quantidade de lodo e com menores teores de metais quando comparados aos coagulantes químicos. Atualmente um dos coagulantes naturais que tem sido mais estudado é extraído das sementes de Moringaoleifera, árvore que pertence à família das Moringaceae, constituída por quatorze espécies distribuídas nas regiões tropicais do planeta, é originária da Índia, contudo está amplamente distribuída nos países da África e Ásia. Atualmente a Moringa oleifera é encontrada em diversos países de clima tropical, inclusive no Norte do Brasil. As sementes possuem propriedades antimicrobianas, anti-tumoral, anti-inflamatórias, diuréticas e anti-espasmódicas.
OBJETIVOS -O presente estudo teve por objetivo verificar o efeito antibacteriano, avaliar um possível mecanismo de ação e a citotoxicidade dos extratos salino e aquoso das sementes de Moringa oleifera, utilizados como coagulante natural em tratamento de águas.
MATERIAIS E MÉTODOS - Preparo dos extratos: as sementes de Moringa oleifera foram obtidas da colheita realizada em junho de 2013 na cidade de Aracajú – SE, acondicionadas em sacos plásticos e armazenadas à 4°C até o momento do preparo do extrato.As sementes de Moringa oleifera foram previamente descascadas, 10g da semente foram pesados e triturados em liquidificador com 100mL de água destilada durante três minutos. A solução de Moringa oleifera foi agitada em baixa rotação com auxílio de agitador magnético durante 30 minutos, filtrada em papel de filtro (Whattman n°1) e filtrada em membrana filtrante 0,45 μm. O extrato foi armazenado em geladeira e utilizado no dia seguinte.Para o preparo do extrato salino, utilizou-se solução de NaCl 1M. O preparo do extrato salino seguiu o mesmo procedimento adotado para preparo do extrato aquoso à 100mg/mL, porém foram utilizadas membranas de diálise de 0,45 μm para retirada do sal. A diálise foi realizada logo após o preparo do extrato numa temperatura de 4°C, o processo de dessalinização foi acompanhado medindo a condutividade da água. Preparação do inóculo e suspensão bacteriana:Os micro-organismos foram adquiridos do banco de cultura do Laboratório de Microbiologia da Água, Ambiente e Alimentos da Universidade Estadual de Maringá-UEM: Staphylococcus aureus (ATCC 25929), Escherichia coli (ATCC 25933), Aeromonas hydrofila (ATCC 7966), Klebisiella pneumoniae (ATCC 700603) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442).A suspensão da célula bacteriana foi preparada conforme procedimento descrito pela CLSI M7-A9.Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM): a atividade antimicrobiana dos extratos foi determinada pelo método de micro diluição em caldo Muller Hinton utilizando placas de 96 poços (TPP® – Techno Plastic Products, Trasadingen, Switzerland). Para a determinação da CBM, foi realizado o subcultivo em placa com Agar Muller Hinton dos poços que apresentaram a CIM e de dois anteriores. Os testes foram realizados em triplicata.Ensaio de citotoxicidade: o ensaio de citotoxicidade dos extratos foi realizado pelo método colorimétrico MTT descrito por Mosmann (1983) utilizando células VERO (African green monkey kidney). Os resultados foram observados por meio de um leitor de ELISA (Bio-Tek Power Wave XS Microplate Fluorescence Reader) numa densidade óptica de 570 nm.Microscopia eletrônica de varredura: Este ensaio foi realizado segundo metodologia descrita por HADDAD et al. (2007), onde foram verificadas alterações morfológicas nas células bacterianas tratadas com os extratos e comparadas as células sem tratamento.
Citometria de fluxo: este ensaio foi realizado para verificar as taxas de sobrevivência e integridade da membrana celular conforme metodologia descrita por Anjos et al. (2013).
RESULTADOS E DISCUSSÃO - CIM e CBM: Os menores resultados encontrados para a concentração inibitória mínima do extrato aquoso foram de 1,56 mg/mL para o micro-organismo S. aureus e 3,12 mg/mL para o micro-organismo A. hydrofila. Já para o extrato salino o micro-organismo que apresentou uma menor resistência ao extrato foi o A. hydrofila com uma CIM de 40mg/mL, seguido dos micro-organismos E. coli e S. aureus, ambos com 70mg/mL, os micro-organismos K. pneumoniae e P. aeruginosa apresentaram a mesma CIM do extrato aquoso, 90 mg/mL.A menor concentração bactericida mínima (CBM) encontrada foi para o extrato aquoso, onde o micro-organismo que apresentou menos resistência foi o A. hydrofila com uma CBM de 6,25mg/mL. A maior concentração bactericida encontrada foi para o micro-organismo K. pneumoniaeque apresentou valores de 100mg/mL para ambos os extratos testados. O extrato aquoso apresentou uma redução de 6,4 log [UFC/mL] para o micro-organismo A. hydrofila, sendo este o que se mostrou mais sensível ao extrato em questão. Já para o extrato salino, o micro-organismo que apresentou maior sensibilidade foi E. coli, que apresentou uma redução de 8,3 log [UFC/mL]. Citometria de fluxo: verificou-se através deste ensaio que houve alteração celular, onde a maior porcentagem de alteração pode ser observada para o micro-organismo S. aureus quando tratado com 10mg/mL do extrato aquoso obtendo então 51,15% de alteração, enquanto que para o mesmo micro-organismo foi necessário o tratamento com 80mg/mL do extrato salino para chegar a uma porcentagem de 50,42% de alteração. Para a E. coli os resultados demonstraram 40,41% de alteração quando tratado com extrato aquoso na concentração de 35mg/mL e 51,7% quando tratado com 80mg/mL do extrato salino. O micro-organismo A. hydrofila apresentou 14,48% de alteração para tratamentos com 5mg/mL de extrato aquoso e 33,73% quando tratados com extrato salino com concentração de 40mg/mL. Microscopia eletrônica de varredura: Verificou-se que houve alterações morfológicas com rompimento e extravazamento celular, estando de acordo com resultados apresentados na análise de citometria de fluxo, podendo ser um dos mecanismos de ação dos extratos de Moringa oleifera. Ensaio de Citotoxicidade: A citotoxicidade dos extratos é medida através da taxa de sobrevivência das células. As células quando viáveis são capazes de metabolizar o MTT transformando-o em formazan, onde os resultados são verificados visualmente e através da contagem de células viáveis. No ensaio de citotoxicidade foi possível avaliar a viabilidade celular e verificar o CC50, ou seja, concentração capaz de reduzir 50% das células VERO. Para o extrato salino a concentração capaz de inibir 50% das células VERO foi de1,9 mg/mL o extrato aquoso apresentou baixa viabilidade na concentração de 0,2 mg/mL estando o seu CC50 abaixo deste valor.Os resultados demonstraram que o extrato salino apresentou uma menor citotoxicidade frente a células Vero quando comparado ao extrato aquoso, além do mais, a capacidade de coagulação daMoringa oleifera extraído com solução de NaCl 1M foi 7,4 vezes maior do que a do coagulante extraído por água destilada para a remoção de turbidez por caulinita suspenso, demonstrando ser promissor para o tratamento não somente de águas para consumo mas também para tratamento de águas residuárias.
CONCLUSÂO - Os extratos da Moringa oleifera demonstraram ter atividade antimicrobiana, tendo destaque para o extrato aquoso sendo queos micro-organismos S. aureus e A. hydrofila apresentaram as menores concentrações inibitória mínima para ambos os extratos testados.
Quanto ao mecanismo de ação dos extratos, o presente estudo demonstrou através dos resultados de microscopia eletrônica de varredura e citometria de fluxo por meio de alterações celulares que os extratos aquoso e salino agem na célula dos micro-organismos testados, porém outros mecanismos de ação não devem ser descartados.Os extratos aquoso e salino apresentaram-se tóxicos para as células Vero nas concentrações em que houve a inibição do crescimento bacteriano, estudos futuros podem ser realizados utilizando o extrato da semente de moringa juntamente com métodos químicos ou físicos a fim de potencializar os efeitos, ou seja, de um efeito sinérgico dos extratos brutos ou compostos isolados da semente, não somente para utilização em tratamento de águas bem como conservantes na indústria alimentícia.É necessária uma investigação mais aprofundada a fim de verificar os componentes que são responsáveis pela citotoxicidade destes extratos juntamente com outras técnicas de purificação para tratamentos de água e utilização de uma concentração que seja eficiente no tratamento de água e que apresente um limite seguro à saúde humana e ambiental.
PALAVRAS CHAVE:tratamento de água, Moringaoleifera, citotoxicidade, coagulante natural.
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